北京基诺博实生物技术有限公司

Q: 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽，直接跑 2D 的一向吗？
A: 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时，可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收，这样跑完 1D 和 2D 胶后，会有很多横向条纹。所以在这种情况下，最好在重泡胀后，将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。
Q: 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少，暴露出了胶条的背面？
A: 这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条，这个盖子上设计了对应的突起，以便压住胶条。由于虹吸作用，这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽，从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中，那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生，可以在相邻的空电泳槽里，也加入适量（ 80 ％满）的矿物油。
Q: 跑第一向时，为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)？
A: 电流的平方和功率成正比。电流增大，功率增大，放出的热量也随之增大，就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时，缓冲液里的尿素就容易解离，产生一些极性分子，从而对等电聚焦产生影响。
Q: 跑第一向时，为什么刚开始的电压比较低，而后逐渐增高？
A: 刚开始时，体系内的带电小分子比较多（比如无机盐和双极性分子）。所以在这个阶段，电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小，移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时（无机盐移动到极性相反的电极；两性分子移动到对应的 pH 条带），体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务，逐渐向所对应的 pH 区域移动。
Q: 跑第一向时，为什么会产生一条蓝色的条带，并逐渐向酸性端移动？
A: 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂，当它移动到酸性区时（ pH4 ），颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后，蛋白质大分子聚焦之前。
Q: 跑第一向时，为什么电压总达不到预定值？
A: 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时，聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。
Q: 跑第一向时，在电压达到预定值后，电流为什么会降低？
A: 当上样量比较少时，所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值，从而变成中性分子。这样，体系的电阻越来越大，在恒定的电压下，电流就会越来越小。
Q: 跑第一向时，为什么在两个电极丝附近有气泡产生？
A: 等电聚焦完成后，所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域，而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子，在阳极产生氧气，在阴极产生氢气。
Q: 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么，双极性分子的作用是什么？
A: 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性，特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后，就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集，从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率，可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用，防止它们的聚集。
Q: 怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值？
A: 可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。
Q: 为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾？
A: 横的脱尾可能是： 1 ）一向等电聚焦不完全； 2 ）某些蛋白质本身的原因（糖蛋白）； 3 ）蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时，蛋白的溶解度不好。
Q: 什么成分会影响 2D 胶的效果？
A: 核酸，盐，去垢剂等等。
Q: 2D 胶的上样量应该在什么范围？
A: 上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些，这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系，上样量大概在 100 微克（银染）到 500 微克（考染）之间。
Q: 我的蛋白质浓度很低，应该用什么方法来浓缩？
A: 蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法，沉淀法和透析法。超滤比较温和，对蛋白质不会有修饰和改变，蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少（被膜所吸附）。另外超滤对样品的要求比较高。甘油，去垢剂都会堵塞滤膜，影响超滤的效果。沉淀法比较快速，容易操作，对盐，甘油，去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来（丢失）。沉淀法中，又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时，一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次，去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品，量小时，操作困难。透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境（不含盐，甘油，去垢剂或其它杂质，比如碳酸氢氨溶液），然后再进行超滤。
酶解篇
Q: 用 Trypsin 酶解蛋白质时，碳酸氢氨的浓度应该是多少？
A: 酶解时碳酸氢氨的浓度一般在 10 - 50 mM 之间。碳酸氢氨的作用主要是提供一个碱性的水解环境，因为 Typsin 的活力在 pH8 - 9 之间最高。最常用的碳酸氢氨浓度有 20 mM ， 40 mM 。盐浓度过大时，后续的冻干过程中会有较多的盐析出；盐浓度过小时，则不能有效的提供碱性 pH 的水解环境（尤其是在样品的 pH 值低，而且体积大时）。为了确定酶解体系的 pH 值，可以用
Q: Trypsin 储存液的作用是什么？
A: Trypsin 在 pH8 - 9 活力最高，所以为了防止酶的自水解， Trypsin 母液要处于一个酸性的环境里以便长期保存。 Trypsin 储存液的 pH 大约是 5.3 ，是用来稀释母液用的。如果所需的酶量较大，可以直接用碳酸氢氨溶液来稀释母液。如果酶解的样品少，可以用储存液来稀释，这样剩余的酶液可以在 -800C 保存到下次使用。
Q: Roche 的酶和 Promega 的酶，那个更好？
A: Roche 的酶有自降解，而 Promega 的酶基本上没有自降解。由于酶的自降解峰可以用来做很好的内标，所以一定限度的酶自降解对 MALDI 数据的校准很有帮助。
Q: 什么情况下需要用 Ziptip 来处理样品？
A: 当样品含有大量的盐时，需要用 Ziptip 来除盐；当样品量很少，但体积比较大时（ 20 微升以上）时，需要用 Ziptip 来浓缩。如果样品中有甘油， SDS ，或其他杂质时， Ziptip 的使用要格外当心，在这种情况下， Ziptip 的填料容易被杂质堵塞；另外 Ziptip 使用不当时，样品会有损失。所以当样品比较珍贵（的来不易）时，最好先用其他样品做预实验，摸顺条件后，再作真正的样品。

Q: 怎样邮寄我的样品？
A: 冻干的胶或干粉可以直接邮寄。切胶后的湿胶（不用做任何处理），放在 EP 管中 ( 不加任何缓冲液 ) ；用干冰速冻；邮寄时，置样品于足够的干冰中。液体样品的邮寄方式同湿胶一样。
Q: 为什么要使用内标？
A: 用内标做校准可以大大减少 MALDI-MS 的误差（ <70ppm ），从而提高查库结果和可靠性。好的内标肽段需要有以下的要求：最好有两个肽（两点一线）；质量不要在大多数的肽段范围内（ 1200 - 2500 Da ）；内标的量要与样品的量成比例；内标对其他肽段离子化的抑止要小。我们实验室使用的内标是 25fmol 的--和--。不过，一般情况下，使用外标做校准也可以达到比较满意的数据（ <150ppm ）。所以，顾客可以根据自己的需要来选择是否使用内标。
Q: 我为什么还要提供正负空白胶正对照提供 (exact) 对照两块胶？
A: 正负对照的两块胶是用来对整个鉴定过程做质量控制的。负对照（空白胶）主要是看样品是否有污染（比如角蛋白的污染）；正对照（已知胶，比如同一块胶上的标准蛋白）主要是检测酶解和质谱的效果是否正常。如果客户不能提供正负对照，我们可以使用自己预先准备的胶条。如果顾客的样品量大（ >10 个 2D 胶上的点），则顾客必须提供正负对照。
Q: 对于胶上蛋白质的鉴定，我应该提供多少蛋白质？
A: 一般情况下，考染能看得见的点都有机会鉴定出来。分子量在 2 － 5 万之间的蛋白质，鉴定成功率一般比较大。分子量小的蛋白酶切位点少，合适的肽段（ 1000 - 3000 Da ）就少，所以鉴定的成功率相对较低。而分子量太大的蛋白质，在同等质量的情况下，蛋白的摩尔数 (pmol) 较少；而且查库时匹配肽段的覆盖率会比较低（因为整个蛋白质较大），从而影响鉴定的成功率。
Q: 为什么我的 MALDI 图谱中都是相差 44Da 的峰，肽段的峰则全被抑制了？
A: 相差 44Da 的峰可能是 Triton X 峰，也可能是 polymer （ -CH2CHOH- ）峰。这些 polymer 是从 EP 管的内壁沥滤（ leaching ）出来的。所以样品中不能含有 Triton X 。另外实验中不能使用加有可塑剂（ plasticizer ）或塑料软化剂的离心管（比如 PCR 管）来装取样品。最好是使用进口 EP 管。另外，可以用 60 ％的乙腈 /0.1%TFA 去清洗 EP 管的内壁以防沥滤。清洗后，要等到残留液都挥发（ air dry or speed vac ）后再装样品。此过程中要注意不让杂质灰尘落入管内。另外，试验操作过程中所佩戴的塑胶手套也可能有可塑剂。所以一定要佩戴无尘的手套。每次用手打开或触摸盛有样品的 EP 管时，一定注意不要碰到 EP 管盖的内壁。开盖时，可以使用 Eppendorf 枪上的金属拉杆（动作如开啤酒瓶盖儿）。从冻干机中取出 EP 管时，最好拿在盖子和管子的连接部分或盖子的突出部分。胶的染色和脱色中，尽量不要触摸胶（即便是带了手套）。可以用厨房用的铲子（带镂空的那种，超市里有卖）来操作。
Q: 各种去垢剂对 MALDI 有何影响？
A: 1.离子型去垢剂对 MALDI 的影响要比非离子型去垢剂大。去垢剂浓度越高，影响越大。
2.在浓度为 1.0% (w/v) 时 : 除了一些糖类的非离子型去垢剂，大部分去垢剂会把蛋白质的信号减低 10 倍。
3.At 0.01% detergent concentration (w/v): 只有 SDS 和牛磺胆酸影响信号。但它们会使信号减低超过 20 倍。
4.在浓度为 0.1% (w/v) 时 : 不同的去垢剂对信号的影响差别比较大。具体效果见下表。信号指有去垢剂时的信号和无去垢剂时的信号之比。
Q: HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法?
A: 1.样品量不足：解决办法为增加样品量
2.样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3.样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4.检测器衰减太多：调整衰减即可。
5.检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数
6.检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。
7.检测池中有气泡：解决办法为排气。
8.记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。
9.流动相流量不合适：调整流速即可。
10.检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
Q: 做 HPLC 分析时，柱压不稳定，原因何在? 如何解决?
A:原因可能有：
1.泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
2.比例阀失效，更换比例阀即可。
3.泵密封垫损坏，更换密封垫即可。
4.溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
5.系统检漏，找出漏点，密封即可。
6.梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
Q: 我购买的 HPLC 柱验收测试时柱压过高，请问为什么?
A: 柱压过高是 HPLC 柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
1.拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；
2.把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。
3.将柱子的进出口反过来接在仪器上，用 10 倍柱体积的流动相冲洗柱子， ( 此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性 ) 。这时，如果柱压仍不下降，再检查；
4.更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题， SGE 提供的 Rheodyne 7315 型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
Q: 液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?
A: 1.筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
2.存在干扰峰，解决办法为使用较长柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子。